豬流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒
(PEDV)引起的一種急性、高度接觸性腸道傳染病，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的危害極大，所以
及早確診對(duì)該病的防治具有特別重要的意義。豬流行性腹瀉病毒的傳統(tǒng)診斷方法
主要有病毒的分離鑒定、免疫熒光抗體試驗(yàn)、免疫電鏡觀察和 ELISA 等方法。
但這些方法操作過(guò)程繁瑣、操作難度大，所需要時(shí)間較長(zhǎng)，專(zhuān)一性不強(qiáng)因此建立
一種快速、高靈敏度的診斷方法對(duì)防治 PEDV 感染是十分必要的。
PEDV 屬于冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirus)，其基因
組為單鏈正股 RNA，其中膜蛋白(M)基因高度保守。本研究根據(jù) PEDV 的 M 基
因設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)引物，提供了 PEDV 的快速、靈敏的鑒別診斷方法，采用
RT-PCR 技術(shù)檢測(cè)疑似感染仔豬糞便或腸道組織樣品中的 PEDV。它具有下列
特點(diǎn)：
1. 用于 PEDV 的定性鑒定檢測(cè)和分子流行病學(xué)調(diào)查。
2. 能對(duì)樣品中 PEDV 進(jìn)行快速檢測(cè)，具有良好的特異性和敏感性。
3. 使用一管式 RT-PCR 試劑盒，減少了操作步驟，降低了操作誤差

運(yùn)輸及保存:

使用方法:

一、樣品 RNA 的制備
將 PEDV 細(xì)胞毒、腹瀉仔豬糞便或腸道組織樣品剪成小塊，加入 5 倍體積
PBS，勻漿處理或組織研磨器研磨，用自選方法純化 PEDV 樣品的 RNA，也可
以另購(gòu)本公司的一管式病毒 RANout 或柱式病毒 RNAout，上述兩款產(chǎn)品跟本
試劑盒兼容。
二、陽(yáng)性對(duì)照
1. 為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體病毒做陽(yáng)性對(duì)
照，只提供沒(méi)有傳染性的、可以直接使用的 DNA 片段作為陽(yáng)性對(duì)照。
2. 使用本陽(yáng)性對(duì)照時(shí)，由于其濃度較高，一定要注意不要污染其他試劑和成分。
最好在專(zhuān)門(mén)的區(qū)域操作。
三、設(shè)置 RT-PCR 反應(yīng)（30 uL 體系）
3. 在 PCR 管中加入下列成分：
成 份 樣品 陽(yáng)性對(duì)照 陰性對(duì)照
雙酶一管式 RT-PCR Buffer，2× 15 uL 15 uL 15 uL
PEDV 專(zhuān)一性引物對(duì) 2 uL 2 uL 2 uL
樣品 RNA 1-5 uL 無(wú) 無(wú)
PEDV 陽(yáng)性對(duì)照 無(wú) 2 uL 無(wú)
補(bǔ)超純水到 28 uL 28 uL 28 uL
MMLV-Taq Mix 2 uL 2 uL 2 uL
4. 輕柔混勻后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 RT-PCR。
過(guò)程 溫度 時(shí)間
逆轉(zhuǎn)錄 60℃ 30 分鐘
預(yù)變性 95℃ 5 分鐘
PCR 反應(yīng)
（35 個(gè)循環(huán)）
95℃ 30 s
52℃ 30 s
72℃ 30 s
延伸 72℃ 7 分鐘
5. 電泳檢測(cè) RT-PCR 產(chǎn)物。預(yù)期的 PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度為 457 bp。